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皮肤致敏试验

前言

过敏性接触性皮炎是皮肤局部接触外源化学品引起的免疫性皮肤反应,相应的皮肤致敏筛查是化学品分类标识、化妆品和皮肤接触产品毒性评价的重要内容。检测致敏物质的传统试验包括豚鼠局部封闭涂皮试验(Buehler test)和豚鼠***大值试验(GPMT test)。为保护动物福利且数量庞大的化学物质、健康相关产品、植物原料等的安全评价也需要高通量的方法进行筛检,皮肤致敏体外方法开发成为当前替代方法研究的热点。经济合作与发展组织OECD在 2012年发布了关于蛋白质共价结合引起的皮肤致敏有害结局通路(Adverse Outcome Pathway, AOP)及基于 AOP原理研发的替代试验相关文件。

化妆品常见过敏原有哪些?

美国食品药品监督管理局(FDA)整理了一些化妆品中常见过敏原清单,主要分为以下五类:

天然橡胶

天然橡胶,在标签中有时也标注为乳胶(latex), 乳胶中多含水溶性蛋白,部分人群容易乳胶过敏。

香精

香精,这是***常见的过敏原,是导致化妆品过敏性接触性皮炎的***主要原因。香料可以是天然或化学合成的。在欧盟,有26种香精过敏源,当它们在驻留产品中(例如面霜和香水)的浓度超过0.001%,在冲洗类产品中(洗发水和沐浴露)的浓度超过0.01%时,必须在产品标签上注明。

26种具体的香精过敏原一共分为3组

A组包括一些经常接到过敏报告的香精成分:

A组.png

B组是相对不常接到过敏报告的香精成分:

B组.png

C组***后补充了两个天然香精成分:

C组.png

防腐剂

防腐剂,防腐剂会杀死污染化妆品的微生物,延长产品的保存时间,它们还会与皮肤发生反应,造成接触性皮炎。防腐剂的类型及其引起的皮炎会随着时间的推移发生变化。当前***容易导致过敏的防腐剂是基二溴戊二腈(methyldibromo glutaronitrile,自2008年起欧洲禁止在驻留产品中使用),甲醛(formaldehyde)及会释放甲醛的成分:聚季铵盐-15(quaternium-15)、双(羟甲基)咪唑烷基脲 (diazolidinyl urea)和咪唑烷基脲(imidazolidinyl urea),异噻唑啉酮类(the isothiazolinones)和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(iodopropynyl butylcarbamat)。

染料、色彩添加剂

染料和色彩添加剂,如p-苯二胺(p-Phenylenediamine)煤焦油(Coal-tar)

金属

金属,如镍(Nickel)、金(Gold)

化妆品皮肤致敏替代方法

皮肤致敏AOP

皮肤致敏 AOP包括4个关键事件(Key event, KEs),其示意图见图1。KE1是化学物质(包括代谢物或非生物转化产物)与皮肤蛋白亲核性氨基酸残基的共价结合;KE2发生在角质形成细胞,包括炎症反应及与特定细胞信号通路相关的基因表达;KE3是树突状细胞的激活,通常通过特定细胞表面标记物和细胞因子的表达水平来评估;KE4是 T细胞的激活和增值。

图1 皮肤致敏AOP示意图.png

图2 皮肤致敏过程的诱导阶段.jpg

KE1及替代方法

KE1指具有亲电作用的致敏物质与表皮蛋白质的亲核位点共价结合,形成半抗原蛋白复合物。以此机理建立了直接多肽反应试验(Direct peptide reactivity assay,DPRA),2015年被采纳为OECD TG 442C通过量化受试物对半胱氨酸和赖氨酸合成肽的反应性,结合高效液相色谱分析来预测受试物致敏性。

表1 半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽判定模型.png

表2赖氨酸多肽判定模型.png

KE2及替代方法

KE2指半抗原蛋白复合物与角质形成细胞作用,导致炎症反应及与特定细胞信号通路相关的基因表达变化。参考OECD TG442D, KeratinoSens试验利用了一种来自人类角质细胞的永生粘附细胞系,该细胞系稳定地携带着荧光素酶报告基因。该基因受人类AKR1C2基因的ARE控制,并会被皮肤致敏剂上调,荧光素酶信号反映了致敏剂对内源性Nrf2依赖基因的激活。这样就可以使用荧光素酶底物定量检测受试物对荧光素酶基因的诱导,作为暴露于皮肤致敏物质后细胞中Nrf2转录因子的活性指标。

图2  ARE-Nrf2荧光素酶试验结果判定.png

KE3及替代方法

KE3指半抗原蛋白复合物作用于未成熟树突状细胞,细胞表面标志物上调,同时释放细胞因子,迁移***淋巴组织,通过主要组织相容性复合物分子将半抗原复合物呈递给 T细胞。参考OECD TG442E,h-CLAT试验是人单核细胞白血病细胞系THP-1暴露于致敏剂后,与单核细胞和树突状细胞(DC)(即CD86和CD54)激活过程相关的细胞表面标记物的表达随之变化。用荧光标记抗体进行细胞染色,用流式细胞术检测表面标记物表达的变化。检测CD86和CD54细胞表面标记物的表达水平即可用于支持皮肤致敏剂和非致敏剂之间的区分。

表3 CD86和CD54判定标准.png

体外皮肤致敏结果判定

OECD TG 442C/442D/442E通常需要按照“2 out of 3”确定方法开展,能够辨别化学物质为致敏物与非致敏物。单独一个关键事件不足以得出化学物质是否存在皮肤致敏潜力的结论。

如果来自两个关键事件的试验方法结果均为阳性,则***终结果为皮肤致敏剂,不需要进行进一步的检测。如果来自两个关键事件的试验方法结果均为阴性,则***终结果为阴性(非皮肤致敏性),不需要进一步检测。如果结果不一致,则需要进行其他关键事件的试验方法。

图3  体外皮肤致敏试验结果判定.png

试验结果在临界区间并高于预测模型的决策阈值时,可以被认为是阳性。这种情况下,两个阳性的试验结果可以得出化学物质具有致敏性。

微谱皮肤致敏体外实验测试方案

微谱皮肤致敏体外实验测试方案1.png

微谱皮肤致敏体外实验测试方案2.png

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