近日，微谱生物医药技术服务专家团队（张晓科、顾寒妮、杨佳佳、张梦洋 、黄荣）撰写的学术论文《高质量包装材料阳性样品计量校准研究》被中国医药包装协会《医药&包装》杂志（2022年第3期总第072期）收录并刊登。

论文如下：

密封性是指包装袋避免其他物质进入或内装物溢出的特征。在药品包装袋的生产过程中，因为生产环节比较多，可能会产生热封合漏封、压穿或材料本身裂痕、微孔，从而造成内外连通的小孔或强度薄弱点，所以如果密封性能不达标，就无法保证药品在有效期内避免一些不良因素的影响，例如温度、光照、溶剂损失、氧气、水蒸气或者微生物污染等，从而导致质量下降。因此，药品在整个有效期内需要有完好的密封性包装，药包材必须要经过专业严格的密封性能测试。确保药品包装的密封完整性，对于药品的卫生性，安全性，质量保证起着重要的作用[1]。CDE发布的《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（征求意见稿）》中关于包装密封性检查方法验证章节指出，要重点关注方法灵敏度的考察，需设立阴性及阳性对照样品[2]。无论选用哪种方法，都要通过阳性对照来验证方法的灵敏度。所以阳性样品的制备就显得尤为重要。阳性对照为一个有已知的、故意缺陷的包装，实验常见的标准阳性样品的孔径为2、3、3.75、5、10、15、20μm，制备误差在±0.1μm之内。因此对于已知缺陷，即微孔的大小，需要一个衡量标准。

阳性样品主要采用激光打孔、滴管和毛细管刺入等方法来制备。激光微孔加工其优势在于激光技术制备的阳性瓶，其漏孔的几何形状和不规则的气流通道接近真实缺陷，可以制备任何材质和孔径大小的阳性样品，不需要引入可能影响泄露检测的其他物质。滴管和毛细管则通常用于软包装材料的阳性样品制备，玻璃微滴管制作阳性样品的孔径可以低***0.1μm，但**非常脆弱，在样品制备过程中很容易损坏，制备完成后滴管周围使用环氧树脂密封完成后，需要在光学显微镜下观察密封完整性，此外滴管中残留的空气会干扰测试结果，都会对微生物的侵入产生较大的影响，并可能产生假阴性的结果。微管是一种内径中空几何形状的圆柱体，一般是由SiO2等材料制造，具有较好的强度和弹性，外部有熔融的聚合物涂层，制备工艺相对比较容易，大于0.2μm的孔径都可以制备，但缺点是长度相对漏孔尺寸大很多，几何形状与现实缺陷差别较大，导致用于微生物挑战试验时验证的灵敏度相对较低。激光打孔、滴管和毛细管刺入法制备阳性样品，滴管和毛细管均是利用已知孔径大小的辅助材料来制备相对应的阳性孔，除保证密封性外，不存在孔径的计量校准问题。但对于激光打孔，尤其壁厚或者材质不均匀的药品包装材料，激光参数可以控制，但孔的深度和大小无法控制，只能通过试错方法创建所需的孔大小，因此每个加工的孔径都需要计量校准，来选取符合实验要求的阳性样品。USP1207中规定泄漏可以被概念化为具有限定直径的孔，或具有独特直径和长度的通道。自然发生的泄漏通常是复杂的多腔曲折路径并且在尺寸或形状上很少是均匀的，即使是人工创造的泄漏，其尺寸、形状和深度也都是不规则的，如用于泄漏测试方法开发和验证的激光微孔缺陷（也称为孔）[3]。因此标定泄漏的大小时，定义测量方法很重要。

孔径的计量，常见的有直接计量、间接计量和综合计量等方法。直接计量利用两点或三点定位，直接测量出孔径，也是***常用的孔径计量方法。例如常见的显微技术，使用显微技术可以得到表面的直观信息，进一步对图像进行分析可得到孔径大小等结果，目前用于孔径表征的显微技术主要包括扫描电镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、扫描隧道显微镜（STEM）、透射电镜（TEM）和光学显微镜等，但考虑到药品包装材料的体积大小和制样的难易程度，对于药品包装材料的阳性样品孔径测量，仅能用扫描电镜（SEM）和光学显微镜，同时也要考虑孔径深度，上述设备未必能看清整个孔径的分布情况，尤其是裂纹孔，很难定义它几何形状，因为其本质为一系列裂纹，无法通过直接计量来表征。因此需要通过中间变量来换算出等效孔径，计算与孔径有关的函数并换算出孔径尺寸。比较常见的有压汞法、液体-液体排除法、流体流动法等。考虑到孔径大小和对后续实验的影响，液体物质比较容易堵塞孔径，因此选取流体流动法里面的气体流动法，以不凝性气体作为起气源（空气或氮气），根据标准孔径尺寸和泄露气体流量之间的关系，通过计量气体泄漏率，可以推算出缺陷的等效孔径，气体泄漏率是在特定温度条件下穿过泄漏路径的气体流速（以质量或体积单位计）的量度，以及穿过阻挡壁的浓度或压差[3]。在某些情况下，例如圆锥孔，在尺寸上是可以直接测量的，但裂纹孔的泄漏孔径大小是基于气体泄漏率确定的。例如，标定孔径为5μm的激光微孔缺陷，可以测定通过缺陷的泄漏率与已知存在标准的5±1μm孔的泄漏率相匹配来进行尺寸确认。

本文参考USP1207，通过激光打孔制备不同规格的圆锥孔，利用气体泄漏率来计算等效孔径，进一步研究等效孔径和直接测量的真实孔径的区别。

1 样品和分析方法

1.1 样品制备

准备同一厂家同一类型的玻璃包材，本次实验全为10ml西林瓶，制备不同孔径大小的阳性瓶，同一规格的阳性瓶误差控制范围为±0.1μm，每个规格制备10支。

表1 阳性样品信息

1.2 分析方法

 阳性样品是在美国 PHOTONICS INDUSTRIES生产的DC型激光上制备，制备条件：频率30KHz，脉宽15-28μs；SEM测试工作在德国Zeiss公司生产的Sigma500型场发射扫描电镜上完成，其中Sigma500测试条件为：电压=1-3kV，WD=5-9mm；光镜拍摄是在MDS-HDMI型数码体视显微镜上进行；漏孔校准是在LCA型数字式气体质量流量控制器上进行。

上述分析均在上海微谱化工技术服务有限公司（现更名：上海微谱检测科技集团股份有限公司）生物医药事业部仪器测试中心完成，本文涉及的图表和数据均属于上海微谱化工技术服务有限公司生物医药事业部。

2 实验结果

2.1 标准漏孔测量结果

本研究采用气体流量计量校准孔径大小，实验过程需保证流量校准系统的稳定性，对流量计分别做2μm、10μm的ATEQ标准漏孔验证。实验过程中每隔1h做一次验证（表2），直***实验完全结束。2μm的标准漏孔泄漏率为0.072sccm/min，该标准漏孔在12个小时内波动范围在0.071-0.073 sccm/min；10μm的标准漏孔泄漏率为1.722sccm/min，该标准漏孔在12个小时内波动范围在1.720-1.723 sccm/min，整体测量如图1所示，说明流量校准系统比较稳定可靠。

表2 标准漏孔泄露率

图1 标准漏孔测试结果

2.2 SEM结果

将制备好的阳性样品-圆锥孔，通过流量计计量，换算出等效孔径，再将上述计量好的样品在SEM上测量其真实孔径，但因激光加工不能保证每个孔均为圆形，会出现部分椭圆或者不规则的孔型，为了保证实验准确性，分别统计孔径的***大和***小直径，利用曲线拟合边界，积分求出各漏孔的面积（表3）。

图2 不同孔型曲线拟合图

表3 SEM测量的孔径大小

根据统计结果，因为孔型的不规则性，本研究中分别取漏孔的***大直径和***小直径。如图3和图4所示，2、3、3.75、5、10、15μm对应的孔径中，2μm其***大直径和***小直径误差范围均在-0.2-0.11μm之内，拟合计算的等效面积误差为-0.04-0.05μ㎡；3μm其***大直径和***小直径在误差范围均在-0.32-0.30μm之内，拟合计算的等效面积误差为0-0.17μ㎡；3.75μm其***大直径和***小直径在误差范围均在-0.29-0.36μm之内，拟合计算的等效面积误差为-0.01-0.65μ㎡；5μm其***大直径和***小直径在误差范围均在-0.01-0.20μm之内，拟合计算的等效面积误差为0.38-0.71μ㎡；10μm其***大直径和***小直径在误差范围均在-0.8-0.7μm之内，拟合计算的等效面积误差为0.70-3.51μ㎡；15μm其***大直径和***小直径在误差范围均在-0.7-0.6μm之内，拟合计算的等效面积误差为0-0.63μ㎡，上述的直径误差和面积误差均在误差范围之内，拟合计算的面积稍大于等效面积，但均在可被接受的范围之内。

图3 孔径大小分布图

图4 面积大小分布图

3 结果分析与讨论

从上述的测试数据可见，相同尺寸规格的阳性样品，其真实孔径和等效孔径非常接近。为了深入探究原因，以下将从流量计量的原理以及对微孔有影响的各项因素来进行进一步讨论，同时也探索一些新的计量方式。

3.1 药品包装材料的泄漏与渗透

泄漏与渗透不同，泄漏是物质（固体，液体或气体）通过包装壁中的破口或包装组件之间的间隙无意进入或逃逸。泄漏也可以指泄漏物质本身，泄漏流速是一种跨越封装屏障存在的泄漏物质的**和/或分压梯度的函数[3]。例如阴性对照样品没有已知泄漏的包装，而不是没有已知渗透的包装，同理阳性对照具有已知的故意缺陷的包装，而不是已知的故意渗透的包装。同时USP1207中规定泄漏是可以概念化为具有限定直径的孔，或具有独特直径和长度的通道。人工创造的泄漏，以激光微孔加工为例，其尺寸、形状和深度都不规则，说明标定泄漏的大小时，如下图所示，图5-1和图5-3是两种典型的微孔，“圆锥孔”和“裂纹孔”，其SEM二次电子图像很明显地表征出两种孔型的差异性，同时光学显微镜（图5-3、图5-4）也说明了泄漏孔道在尺寸或形状上很少是均匀的。

此外应该注意渗透和泄露的区别，渗透是流体进入、通过和流出无孔包装壁的通道，当只有一小部分分子能够通过任何一个孔移动通过屏障的现象。

图5 不同缺陷（类型）的孔型

3.2 流量计量原理及有效性

多种新型技术在整个密封性泄露检测中具有较多的应用[4-10]，以及其相对应的标准[11-15]。本研究主要关注气体泄漏率和相对应的泄漏孔径尺寸关系，参考国内外相关指导原则，其对应关系在理论上是大致相当，而非**。具体数值会随产品包装、检测仪器、检测方法参数和测试样品制备等不同而变化[16-18]。

在一组或者多组已知的受控条件下，任何气体或者液体的流量都可以被预测。许多变量因素会影响流量计量校准孔径，例如开孔直径，流体随孔的大小直接变化或者随着开孔直径大小的平方改变，影响孔径的其他变量包括入口的形状、孔相以及直径的深度，其中一些变量会对气体和液体产生不同的影响，使用流量孔径代替测量孔径，进行计算可以消除大多数流量变量，同时该计算的等效直径与实际直径仅相差百分之几[19][20]。如图6所示，本实验中泄漏率与孔径分布呈指数增长关系，同时测量的等效孔径和实际计算的面积相差均在很小的范围之内，***大不超过4.5%，说明流量计量的准确性。

其中Flow=cm³/min，

P1=进气压力；

P2=出口压力，ΔP=P1-P2；

d1=孔径大小（气体条件）；

Temp°R=兰金温度；

气流计算常数=0.01794；

Factor#3=ΔP/P小于0.5时用于计算气体流量的因子；

M.W=气体或气体混合物的分子量。

表4 泄漏率与对应孔径

图6 泄漏率与孔径分布关系

3.3 新技术的综合应用

完整性测试方法不仅在其应用和检测极限方面不同，而且在检测范围，**度和特异性方面也不同，没有一种测试适用于所有包装或所有泄漏测试应用，因此需要提供包装完整性测试方法的选择标准以及多样化的计量方式，同理使用流量计也不可能解决所有类型的药品包装材料人工漏孔的计量校准。

图7 两类医药包材图片

常用的药包材按其材料组成，分为玻璃、橡胶、塑料和金属材料四类，玻璃材料因其化学性质稳定当属目前***常用的药包材，其中以硼硅玻璃和钠钙玻璃为主流[21]。按照包材本身的封闭性玻璃可以分为两类（图7），一类有开口，例如安瓿瓶、西林瓶、卡氏瓶等，制备的此类阳性样品（刚性包装材料），其“圆锥孔”和“裂纹孔”都可以用流量计量校准孔径，尤其是“裂纹孔”，实际上是一系列裂纹，很难定义其几何形状，因此只能用流量计量。另一类没有任何开口，本身全密封，例如聚乙烯材质药用单剂量滴眼剂瓶、软质输液袋、瓶等（柔性包装材料），阳性样品的制备通常以滴管或毛细管插入法为主，但其滴管中残留的空气会干扰测试结果，对微生物的侵入产生较大的影响，并可能产生假阴性的结果；而毛细管的缺点是长度相对漏孔尺寸大很多，几何形状与现实缺陷差别较大，导致用于微生物挑战试验时验证的灵敏度相对较低。

高质量、精细的激光微孔加工可以解决上述问题，结合光学景深扩展3D技术和CT扫描孔径等新技术的应用可以解决孔径计量，因材料的特殊性，激光微孔加工很难像对玻璃包材那样加工出多种孔型，基本都以“圆锥孔”为主，整体比较规则。如图8所示，利用特殊光源或者X-射线均可对其实现孔径的逐层扫描和重建，完成表面临摹的3D可视化技术和景深扩展3D重建，同时可消除传统滤光器带来的眩光。此外，亦可以测量其孔径大小，方便简洁，同时不会对阳性样品造成损伤和污染，确保微生物实验的顺利进行，不会对其结果产生影响。

3.4 阳性样品储存

阳性样品的孔径较小，一般在2-20μm之间，容易堵塞，尽量不要重复利用；如样品用于确定性方法开发验证，未被破坏的阳性样品可用于概率性方法（色水、微生物挑战），但如果用于概率性破坏性方法，漏孔接触水溶液后，则禁止重复利用；样品需要在洁净包装内密封保存，不能长时间暴露在空气中，严禁暴露在灰尘环境、温差变动大的环境中。使用过程中严禁用手直接接触阳性样品，特别是漏孔部位，操作人员必须戴干净手套后接触阳性样品且不要接触到漏孔的位置；样品长时间未使用，复验期建议为3-6个月。

卡氏瓶和预罐封等带胶塞的瓶子，一般为保护胶塞会涂抹一点甲基硅油类的物质，以增加其抗氧化性、防止其变硬变脆以及增加胶塞的润滑性，因此通常瓶子内壁较湿润。硅油一般是涂抹在瓶子内壁，硅油具有一定的流动性，重力作用或者温度变化都会导致其流入到微孔里面，进而堵塞微孔，建议在微孔加工之前做清洗处理。

此外正常灭菌程序处理也会有堵孔现像，该现象主要与瓶身内壁洁净度相关，内表面沾染的异物等遇到液体会分散到里面流入漏孔，进而使漏孔堵塞。如肉眼可见有明显异物，建议打孔前做清洗处理。

4 结论

阳性样品的制备非常重要，一方面要尽量模仿产品实际泄漏的情况，一方面要避免产生假阴性结果的影响因素，避免毛细管过长，尽量接近包材本身的厚度，或避免滴管内含有气体等问题。

没有一种计量方式适用于所有泄漏的计量校准，因此需要选择合适的计量方式，不论是直接计量，还是间接计量，都需要贴合实际的情况而定。对于开口包材，其“圆锥孔”和“裂纹孔”都可以用流量计量校准孔径，“圆锥孔”的校准方式比较多样化，直接测量和流量校准均能满足其需求，而“裂纹孔”则因它难定义的几何形状，只能用泄漏率换算，流量计量。而对于塑料类的软包装材料，使用滴管和毛细管刺入法制备阳性样品，滴管和毛细管均是利用已知孔径大小的辅助材料来制备相对应的阳性孔，除保证密封性外，不存在孔径的计量校准问题，而若用激光微孔加工的软包装材料，考虑实际情况，在传统光学设备上升级的景深扩展3D技术和CT扫描孔径等新技术可以无损、有效的计量，使得实验的结果更加趋近于真实情况。

阳性样品制备的前处理过程和储存过程同样重要，是多个环节的相互配合，任何一个环节出问题，都会导致整个实验项目的不理想或者失败。确保药品包装的密封完整性，对于药品的卫生性，安全性，质量保证起着重要的作用，因此需要我们严格遵守，不能有任何纰漏。

内容来源：素材来源于《医药&包装》2022年第3期 总第081期